Protocoles Culots protéique et préparation Facs

Solutions de départ

• PBS 1x Froid
• HBSS
• ABB 1x
• Anticorps/Marqueurs
  • CD45 APC (~ 3µL)
  • CD15 APC (~ 15µL)
  • CD38 PC7 (~ 12µL)
  • Rhod2 (~ 7µL)
  • Annexin V - BV421 (~ 2µL)
• Billes de compensation
• Flasques cells

Culots

2M de cells @ 0.4M/mL -> environ 5mL (dépend de la concentration réelle qui doit être supérieure à 0.4)

• 5 minutes @ 1200 RPM 4°C
• Lavage PBS froid 1x 1mL
• 5 minutes @ 1200 RPM 4°C
• Lavage PBS froid 1x 1ml
• 5 minutes @ 1200 RPM 4°C
• Congélation -20°C culot

Attention ! Toujours être dans la glace

FACS

• Préparer les cubes comps
  • Tube comp 1 = Rhod2 (PE)
    • 100µL HBSS
    • Rhod2 = 1/100 = 1µL
  • Tube comp 2 = CD15 - APC (CD45-APC)
    • 100µL HBSS
    • 1µL CD45 APC
    • billes (bleus + blanches)
  • Tube comp 3 = CD38 - PC7
    • 100µL HBSS
    • 1µL CD38 PC7
    • billes (bleus + blanches)
  • Tube comp 4 = AnnexinV
    • 100µL HBSS
    • 1µL AnX - BV421
    • 200µL Cellules mortes (M14+DMSO)
  • Tube comp 5 = GFP
    • 100µL HBSS
    • 200µL 56-11
  • Tube comp 6 = non marqués
    • 100µL HBSS
    • 200µL M14
• 20 minutes de marquage

Marquage

4 tubes :

• 56-11 DMSO
• 56-11 AGI
• Molm14 R132 DMSO
• Molm14 R132 AGI

Mix marqueurs :

• Rhod2 : 5µL
• CD15 APC : 15µL
• CD38 PC7 : 10µL
• HBSS : 500µL

I - Préparation des tubes :

• Récupérer 200µL de Cell par tube
• centri 1200 RPM 4 minutes
• lavage avec 2mL de HBSS
• 100µL de mix
• Vortex
• Incubation 20minutes à 37°C

II - Preparation des tubes (+comps) :

• centri 1200 4 minutes
• lavage avec 2mL de HBSS
• centri 1200 4 minutes
• lavage avec 2mL de HBSS
• centri 1200 4 minutes
• Eliminer surnageant
• 100 µL ABB 1x + 1µL Anx - BV421
• Cytomètre

Volumes finaux : 100µl par tube environ

Questions

• Quel volume billes ? 1 goutte de chaque
• Quel volume cellules mortes avec DMSO ? 200µL

Notes :

HBSS : Hanks’ Balanced Salt Solution, Permet de maintenir des cellules exposées à un milieu exposé à des conditions atmosphériques. (Buffer system)
ABB : Antibody Binding Buffer

Ac anti CD15 n’est pas IgGkappa -> Ne fonctionne pas avec les billes.

Pour les culots westerns c’est 2 à 5 Millions. 2 Millions suffisent pour ce que tu fais.

Pour les marquages. C’est pas 1h à 1h30! C’est 20 min avec Rhod2+Ac de surface.pour le reste ça semble bon mais n’oublie pas de mettre l’Annexine avec ton ABB. Attention ne parle pas de fixation pour ces marquages les cellules sont vivantes. Et oui, le marquage se fait en HBSS.